近日，日本京都大學(xué)博士畢業(yè)生、目前在美國芝加哥大學(xué)從事博士后研究的錢年超和合作者開發(fā)出一種全新的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)——立體 DNA 顯微鏡。

圖 | 錢年超（錢年超）

研究中，他們成功重構(gòu)了 24hpf 斑馬魚胚胎的三維形態(tài)，并以三維方式重現(xiàn)了 Stereo-seq 捕獲的空間基因表達(dá)模式，證明該技術(shù)在構(gòu)建組織樣品三維空間轉(zhuǎn)錄組上的可行性。

另外，他們還開發(fā)了一種名為測地譜嵌入（GSE，Geodesic Spectral Embeddings）的數(shù)據(jù)降維方法，其能處理測序數(shù)據(jù)以及重構(gòu)斑馬魚胚胎的圖像，為非線性大數(shù)據(jù)的降維提供了一種新工具。

之所以能夠?qū)崿F(xiàn)以上成果，是因為他們在無需依賴微流控系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡等特殊設(shè)備和先驗知識的前提下，使用滾環(huán)擴(kuò)增這一等溫擴(kuò)增方法產(chǎn)生的 DNA 納米球可以將 RNA 的遺傳信息進(jìn)行空間編碼，進(jìn)而能夠使用 DNA 分子標(biāo)記 DNA 納米球的鄰近關(guān)系，而后可以針對 DNA 進(jìn)行測序和數(shù)據(jù)分析。

論文發(fā)表之后，錢年超等人受到Nature Biotechnology期刊編輯邀請發(fā)表了一份研究簡報，該簡報由錢年超等論文作者、期刊編輯和行業(yè)專家共同完成的，是對本次成果的概括和評價。在簡報中，專注于單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)的生物技術(shù)公司的瑞典公司 Pixelgen Technologies 的 CEO 西蒙?弗雷德里克松（Simon Fredriksson）教授評價稱：“這項工作為三維、無偏見地分析生物學(xué)提供了一條途徑，這將是一項偉大的成就。在沒有光和熒光團(tuán)的情況下定位生物分子具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)顯微鏡的潛在可擴(kuò)展性。”

目前，本次立體 DNA 顯微鏡可以獲得 24hpf 斑馬魚胚胎的三維空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)，但是仍然還沒有實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率。未來，他們將會持續(xù)優(yōu)化這一技術(shù)。

（Nature Biotechnology）

若干年后，如能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率，可能產(chǎn)生潛在的應(yīng)用有：

首先，目前立體 DNA 顯微鏡僅能獲得三維空間轉(zhuǎn)錄組信息，但是由于該技術(shù)有很好的可擴(kuò)展性，因此未來有望實(shí)現(xiàn)空間基因組、空間蛋白組、空間 ATAC-seq 等三維空間多組學(xué)以及三維時空組信息的檢測；其次，本次成果可以提高檢測腫瘤微環(huán)境的維度，確定完整組織中與癌細(xì)胞相互作用的免疫細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞；再次，可以解析胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而發(fā)掘決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵微環(huán)境組分；最后，可以與電子顯微鏡互補(bǔ)，繪制大腦的連接組。

（Nature Biotechnology）

開發(fā)立體 DNA 顯微鏡，解決現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的局限性

在開展本次研究之前，錢年超主要研究發(fā)育和病毒感染過程中膜蛋白的功能和分子機(jī)制。在研究膜蛋白的分子機(jī)制過程中，錢年超發(fā)現(xiàn)他所研究的三種膜蛋白 TRIC-B、TRPM7 和 TMEM120A 均非獨(dú)立發(fā)揮作用，而是都要與周圍的其他蛋白質(zhì)或者小分子相互作用才能完成一定的功能。這讓他意識到在微米甚至納米層面上，膜蛋白周圍環(huán)境中的生物分子對其正常功能的重要性。

但是，當(dāng)時研究單個膜蛋白的分子機(jī)制至少需要 2 年，主要原因是當(dāng)時所用的技術(shù)手段太局限。比如，傳統(tǒng)的免疫熒光染色和熒光原位雜交等技術(shù)，雖然可以定位已知蛋白質(zhì)、RNA、DNA 等生物大分子，并能根據(jù)已有文獻(xiàn)和研究者經(jīng)驗去驗證可能與它們相互作用的其他分子，然而往往通量較低即一次可檢測的分子數(shù)量較少，而且只能檢測已知目標(biāo)。使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)固然可以高通量地檢測單細(xì)胞中的 RNA 分子，但是無法確定它們之間的相互作用。

顧名思義，相互作用——就是在空間上接近并互相影響，所以如能獲得生物分子的空間信息，就可以在一定程度上推定它們之間的相互作用。2016 年，空間轉(zhuǎn)錄組概念被提出之后，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)很快就被Nature Methods評為“2020 年年度技術(shù)”，至今已經(jīng)進(jìn)入快速發(fā)展時期。而且隨著空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，腫瘤微環(huán)境等方向已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)之所以能夠迅速崛起和得到廣泛應(yīng)用，就是因為該技術(shù)既可以高通量地檢測 RNA 和細(xì)胞類型，又可以保留它們在組織內(nèi)的原位空間信息。它可以為組織樣品繪制一張詳細(xì)的“地圖”來展示 RNA 在其中的空間位置，這樣就能推測細(xì)胞-細(xì)胞之間、RNA-RNA 之間的相互作用。錢年超表示：“之所以用‘推測’，沒有用‘明確’，是因為目前的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)還有很多局限性。”

這些局限性主要是：

首先，由于沒有單細(xì)胞分辨率，因此需要使用復(fù)雜的算法來進(jìn)行細(xì)胞分割；其次，只能檢測 2D 組織切片，而且由于需要在 2D 平面上標(biāo)記 RNA 的空間信息，導(dǎo)致現(xiàn)有標(biāo)記技術(shù)都需要把組織強(qiáng)行地像素化。雖然可以把連續(xù) 2D 組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合成 3D 形式，但是在切片制備的過程中 RNA 難免會丟失或錯位，同時數(shù)據(jù)整合過程也極具挑戰(zhàn)性。另外，即使 2D 組織切片也會有一定的厚度，也就是說它并不是純粹的 2D 平面，所以不同細(xì)胞的 RNA 難免會重疊投射到 2D 平面上；再次，需要特殊的儀器設(shè)備或試劑，導(dǎo)致應(yīng)用成本較高。

這些局限性共同限制了該技術(shù)的可擴(kuò)展性和進(jìn)一步普及。2019 年，美國芝加哥大學(xué)教授約書亞·溫斯坦（Joshua A. Weinstein）教授和團(tuán)隊（即錢年超目前的合作導(dǎo)師）發(fā)表了一篇Cell論文并提出“DNA 顯微鏡”這一概念。DNA 顯微鏡是將 RNA 的遺傳信息通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR，Polymerase Chain Reaction）來原位擴(kuò)增并用分子識別碼（UMI，Unique Molecular Identifier）標(biāo)記為 DNA。

隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，DNA 會以 RNA 為中心向外擴(kuò)散形成 DNA polonies，然后通過重疊延伸 PCR 將相鄰的 DNA polonies 用事件識別碼（UEI，Universal Event Identifiers）來串聯(lián)標(biāo)記，最后針對所得的串聯(lián) DNA 分子進(jìn)行測序和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而重構(gòu)出 RNA 的相對空間位置。

當(dāng)時，錢年超正在清華大學(xué)做博士后，看到這篇論文時給他的第一印象就是很酷。反復(fù)閱讀以后，他意識到 DNA 顯微鏡或許能夠克服現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的缺陷。于是，錢年超申請并加入溫斯坦教授團(tuán)隊，希望能把 DNA 顯微鏡應(yīng)用到 3D 組織樣品中。但是，當(dāng)時的 DNA 顯微鏡受到 PCR 條件的限制，因此只能用于 2D 培養(yǎng)細(xì)胞中。在和溫斯坦教授討論之后，錢年超決定使用等溫擴(kuò)增方法來替代 PCR，以便能夠重新設(shè)計 DNA 顯微鏡。研究中，他和合作者嘗試了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP，Loop-Mediated Isothermal Amplification）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA，Rolling Circle Amplification）兩種等溫擴(kuò)增方法，最后發(fā)現(xiàn) RCA 的效果最好。

基于此，錢年超等人通過展開本次研究，旨在開發(fā)立體 DNA 顯微鏡來解決現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的局限性，以便實(shí)現(xiàn)真正意義上的具有單細(xì)胞分辨率的 3D 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，并使用該技術(shù)去研究在發(fā)育和病毒感染過程中，生物大分子和細(xì)胞的空間微環(huán)境以及它們的相互作用。

（Nature Biotechnology）

通過 DNA 納米球來標(biāo)記 RNA 的空間信息

由于溫斯坦教授此前發(fā)表的Cell論文僅僅使用 DNA 顯微鏡檢測了培養(yǎng)細(xì)胞的甘油醛 - 3 - 磷酸脫氫酶和β- 肌動蛋白的空間分布，并重構(gòu)了培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)。所以，在本次研究的初期，錢年超直接將 DNA 顯微鏡用于三維組織樣品。具體來說，他使用多聚胸苷引物（poly（T），polythymidine）替換了上述Cell論文中所使用的基因特定引物來逆轉(zhuǎn)錄 RNA。然后，他進(jìn)行了 DNA 顯微鏡的后續(xù)操作，借此成功重構(gòu)出細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的分布，并構(gòu)建了它的二維空間轉(zhuǎn)錄組。隨后，他們使用 DNA 顯微鏡檢測了 24hpf 斑馬魚胚胎的空間轉(zhuǎn)錄組，但是所生成的可用于測序的 DNA 產(chǎn)量很低，完全無法用于重構(gòu)斑馬魚胚胎的形態(tài)。

經(jīng)過反復(fù)推敲他們意識到，PCR 過高的變性溫度以及快速的升溫過程和降溫過程，都會影響 PCR 反應(yīng)在三維胚胎中的順利進(jìn)行，也會影響反應(yīng)產(chǎn)物在樣品中的均勻擴(kuò)散。

如前所述，他們一共嘗試了 LAMP 和 RCA 這兩種等溫擴(kuò)增方法。由于 LAMP 生成的產(chǎn)物比較復(fù)雜，所以他們并未得到較純的目標(biāo) DNA 產(chǎn)物。令人興奮的是，RCA 能夠給出清晰的目標(biāo)產(chǎn)物。于是，他們圍繞 RCA 重新設(shè)計了 DNA 顯微鏡技術(shù)，即設(shè)計出了立體 DNA 顯微鏡技術(shù)，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化。

最初的實(shí)驗設(shè)計如下：

第一，使用 poly（T）原位逆轉(zhuǎn)錄 RNA 生成 cDNA；第二，使用 cDNA 的 3 端連接兩種 RCA 引物；第三，將含有不同 UMI 的兩類單鏈環(huán)狀 DNA 退火結(jié)合到 RCA 引物；第四，使用滾環(huán)擴(kuò)增方法生成 DNA 納米球，進(jìn)而編碼 RNA 的空間信息（UMI-cDNA）；第五，由于鄰近 DNA 納米球之間橋聯(lián)含有 UEI 的 DNA 分子，因此將相鄰 DNA 納米球上的 UMI 拷貝到含 UEI 的 DNA 分子上生成 UMI-UEI-UMI，從而記錄 DNA 納米球的鄰近關(guān)系；第六，測序 UMI-cDNA 和 UMI-UEI-UMI，并分析測序數(shù)據(jù)。

以上便是他們的設(shè)計雛形，基本原理是通過 DNA 納米球來標(biāo)記 RNA 的空間信息，以及通過鄰近 DNA 納米球之間形成橋聯(lián)分子來標(biāo)記其鄰近關(guān)系。

圍繞上述設(shè)計雛形，他們開始了為期大約一年的優(yōu)化過程。依托在培養(yǎng)細(xì)胞上的便利性，最初錢年超使用培養(yǎng)細(xì)胞來對設(shè)計中的每一個酶促反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。他和合作者一般做到 RCA 產(chǎn)生 DNA 納米球為止，以便確定設(shè)計前半段的反應(yīng)條件。由于在 RCA 反應(yīng)中加入了熒光色素標(biāo)記的 dUTP，因此所產(chǎn)生的 DNA 納米球會帶有熒光。經(jīng)過 RCA 反應(yīng)之后，在熒光顯微鏡之下，通過檢測熒光信號的強(qiáng)弱就可以判斷反應(yīng)條件的好壞。

完成前半段的反應(yīng)條件優(yōu)化后，錢年超開始進(jìn)行端到端的實(shí)驗，由于他已經(jīng)知道 UMI-cDNA 和 UMI-UEI-UMI 這些預(yù)期產(chǎn)物的片段大小，因此通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測端到端實(shí)驗的產(chǎn)物，就可以基本確定反應(yīng)條件的好壞。然后，通過進(jìn)一步測序和分析測序數(shù)據(jù)，就可以定量產(chǎn)物的多少。

通過使用培養(yǎng)細(xì)胞將實(shí)驗條件優(yōu)化之后，接下來錢年超轉(zhuǎn)向了用受精后 24 小時（24hpf）斑馬魚胚胎做基準(zhǔn)測試。因為斑馬魚胚胎很容易大量獲取，也是研究早期胚胎發(fā)育的有力模型，以及基于培養(yǎng)細(xì)胞與三維斑馬魚胚胎在細(xì)胞數(shù)量、試劑通透性等方面的差異，錢年超用斑馬魚胚胎又進(jìn)行了為期一年左右的優(yōu)化實(shí)驗。這時，他終于可以用測序數(shù)據(jù)重構(gòu)斑馬魚胚胎的三維形態(tài)。

（Nature Biotechnology）

UMI-UEI-UMI 的產(chǎn)量決定了形態(tài)重構(gòu)的成功與否。但是，他得到的 UMI-cDNA 產(chǎn)量依然很低，因為 24hpf 斑馬魚胚胎有大概 25,000 以上的細(xì)胞，每個細(xì)胞檢測 400 個不同 UMI-cDNA，就需要 1,000 萬個 UMI-cDNA。為了解決這一挑戰(zhàn)，錢年超又進(jìn)一步優(yōu)化了實(shí)驗條件，主要通過引入了“DNA 納米球降解”和“體外轉(zhuǎn)錄”這兩個核心策略。其表示，DNA 納米球降解可為后續(xù)酶反應(yīng)釋放納米球所占的空間，方便酶促反應(yīng)的組分?jǐn)U散；體外轉(zhuǎn)錄可以增加產(chǎn)物的拷貝數(shù)，減少丟失產(chǎn)物的風(fēng)險。

經(jīng)過精心的實(shí)驗設(shè)計和多輪的實(shí)驗條件優(yōu)化，他最終成功地開發(fā)出了立體 DNA 顯微鏡，目前可以構(gòu)建 24hpf 斑馬魚胚胎的三維空間轉(zhuǎn)錄組。

圖 | 相關(guān)論文（Nature Biotechnology）

日前，相關(guān)論文以《使用立體 DNA 顯微鏡對完整生物進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組成像》（Spatial transcriptomic imaging of an intact organism using volumetric DNA microscopy）為題發(fā)表在Nature Biotechnology[1]，錢年超是第一作者，約書亞·溫斯坦（Joshua A. Weinstein）擔(dān)任通訊作者。

參考資料：

1.Qian, N., Weinstein, J.A. Spatial transcriptomic imaging of an intact organism using volumetric DNA microscopy.Nat Biotechnol(2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02613-z

運(yùn)營/排版：何晨龍