“我們成功研發了世界上第一例固載化的類核糖體分子反應器（RMMR，Ribosome-Mimicking Molecular Reactor），并一舉攻克了結構中含有多個密集 N-Me 氨基酸或 α,α-二取代氨基酸的高空間位阻多肽的高效固相合成和自動化機器合成技術。”南京大學教授姚祝軍告訴 DeepTech。

圖 | 姚祝軍（姚祝軍）

可能是幾十年來 SPPS 領域為數不多的重大突破之一

很多人都知道，生物學“中心法則”中 RNA 翻譯到蛋白質這一過程發生在核糖體。翻譯時，核糖體小亞基先與從細胞核中轉錄得到的信使 RNA 結合，讀取 mRNA 信息再結合核糖體大亞基構成完整的核糖體，將轉運 RNA 運送的氨基酸分子合成多肽。在本次研究中，該團隊把核糖體視作一架巨大的多肽制造“分子機器”，經不斷的思考、討論和修正，逐步形成了一種“跳出傳統 Merrifield SPPS 習慣思維”的新思路：即模擬核糖體的蛋白質翻譯過程，使類似的“肽酰”和“氨酰 tRNA”單元相互靠近并發生分子內“ON”酰基轉移而形成目標肽鍵，克服現有 SPPS 技術在反應原理上掙扎的效率困境。

RMMR 分子反應器包含兩個關鍵部分：一個多肽合成把手區（模擬肽酰 tRNA）和數個酰基活化區（模擬氨酰 tRNA）。將其固定至商用樹脂表面即成為可循環運作的反應平臺。RMMR SPPS 通過 RMMR 反應平臺進行氨基酸活化并快速與多肽鏈 N 端氨基發生“偽均相”酰基轉移反應，從根源上解決了傳統 SPPS 兩相間酰基轉移的低效率問題。這種由可循環工作的分子機器實施的目標肽鍵形成方案，就像換了一個賽道完全顛覆了傳統 Merrifield SPPS 合成的工作原理和反應模式。同時，這種迭代 RMMR 方法也承接了傳統 SPPS 在氨基酸活化酯方面的部分成就，賦予其操控反應的“開/關”控制：商用的 N-Fmoc 氨基酸與溫和廉價縮合劑 DIC 所形成的活性中間體將 RMMR 樹脂上的活化功能區“turn on”，隨后根據空間鄰近效應介導發生分子反應器“內/間”快速酰基轉移，從而形成目標酰胺鍵；而那些前一流程未被反應掉的活化功能區則在隨后哌啶處理支載多肽末端 N-Fmoc 保護基的同時也被“turn off”，準備好迎接下一輪氨基酸的縮合循環。這一過程不僅可以實現高度的可重復運作，而且操控十分簡單，因此適配于自動化多肽合成平臺。

（Nature Chemistry）

實驗結果表明，RMMR SPPS 方法能以高至 98% 的效率合成含 N-甲基和 α，α-雙取代兩類大位阻氨基酸的多肽序列。在多種常見的 N-甲基氨基酸/α，α-雙取代氨基酸位置前后均可高效縮合不同性質的氨基酸，前/后相對位置不影響縮合效率；同時，序列中可連續或非連續地高效縮合多個大位阻氨基酸。該方法還首次實現了同時存在兩種類型大位阻氨基酸的多肽序列的高效縮合，并以 90% 效率完成了難度極大的“Aib-NMeval”型酰胺鍵的形成。

此次新技術在多種具有重要生理活性的大位阻多肽天然產物的固相合成中展現出色優勢。例如，采用 RMMR SPPS 的 cyclosporin A 類似物合成范例顯示，其中含有 7 個 N-Me 氨基酸的鏈狀 11 肽粗產品的純度可達 88%，分離純化產率可達 70%，大大超越了現有文獻報道的結果。范例中還包括了抗菌肽 alamethicin F 衍生物的 RMMR SPPS，該二十肽序列中包含了八個 α-甲基丙氨酸（Aib）殘基，其機器自動化合成的粗產品純度可達 88%，分離純化后產率為 73%，結果相當驚艷。

總而言之，RMMR SPPS 創新技術籍由迭代科學思維，突破了 60 多年來傳統固相多肽合成法無法克服的原理性限制，實現了溫和條件下高空間位阻難合成肽鏈的高效組裝，是一項在多肽固相合成和自動化合成領域具有里程碑意義的重大突破。RMMR SPPS 技術可望極大加速含有 N -甲基化和 α，α-雙取代氨基酸的多肽藥物探索，為未來口服及作用于細胞內靶點的肽類藥物候選分子的發現和生物相容性材料的研究開發帶來重大突破機遇。

審稿人評價稱：“該概念簡單且巧妙，依賴于一種量身定制的聚合物固體支持物，其中樹枝狀四價 HOBt 或 Oxyma? 衍生物被接枝到固體支持物的上游，用于錨定和延長待延伸的肽鏈的可裂解連接體。HOBt 衍生物和 Oxyma? 都是經典添加劑（或偶聯劑如 HBTU 或 COMU 等許多其他偶聯劑的亞組分），用于形成氨酰基活化酯，這些活化酯是當前大多數 SPPS 方案中酰胺形成偶聯反應的反應物，通過 O-N 酰基轉移從溶液相轉移到生長肽鏈的固體支持胺中。”

審稿人還表示：“與使用傳統 SPPS 方案相比，結果絕對令人震驚且具有說服力，當合成的肽含有 N-甲基化或季銨氨基酸時，其粗品純度得到了顯著且大幅度的提升。在我看來，這極有可能是幾十年來 SPPS 領域為數不多的重大突破之一，其技術突破程度或許可與 Fmoc-SPPS 的發明或 ChemMatrix、PEGA 等極性樹脂的開發相媲美。從這個意義上說，我認為這一新概念的發明非常具有價值且值得在Nature Chemistry這一頂尖化學期刊上發表。”

姚祝軍表示，RMMR SPPS 不僅可以高效合成各種高空間位阻多肽，而且全面兼容現有 Merrifield SPPS 涉及的所有工作范圍，包括自動化儀器平臺，這兩種技術在操作中還可以實現自由切換使用。因此，RMMR SPPS 的原理與技術在一定意義上可以稱作是新一代或迭代固相合成技術。

RMMR SPPS 新技術將會在以下幾個方面帶來巨大機遇：1）肽藥設計的范圍將被拓展，將能觸及到以前不可能獲得的化合物禁區；2）現有具有先天缺陷的肽藥將獲得新的優化機會，比如提升藥物口服利用度等；3）賦予研究者逐鹿肽類藥物跨膜靶向胞內受體的各種機會；4）能夠融合 AI 技術研制新一代 SPPS 自動化合成（實驗室）儀器平臺。

（Nature Chemistry）

惡名昭著的頭號“難肽”

多肽和蛋白質是生命體最重要的基礎物質，其化學結構由各個氨基酸通過肽鍵（酰胺鍵）依次相連而形成。由于分子內和分子間的氫鍵等非鍵相互作用而發生局部結構扭轉或形成折疊，最終成為各式各樣具有不同三維結構的生理功能物質。肽類藥物因其生物相容性等優勢近年來受到重點關注且發展迅速，但同時也受到其固有的代謝穩定性和透膜性差的嚴重制約。研究顯示，在肽骨架中引入 N-甲基或 α-烷基化氨基酸可明顯改善化學穩定性和膜通透性，從而增強肽類化合物的“成藥性”。當今風靡全球的降糖減重藥物“司美格魯肽（Semaglutide）”就是天然的人胰高糖素樣肽-1（GLP-1，glucagon-like peptide-1）的結構修飾物，其中的化學改造就包括在結構中插入了一個 α-烷基化氨基酸（Aib,U）來延長代謝半衰期，由于效果極為明顯其成為了一例新型長效的胰高糖素樣肽-1 受體激動劑，被用于了成人 2 型糖尿病患者的血糖控制。

當前，絕大多數的多肽都可通過美國著名生物化學家布魯斯·梅里菲爾德（Bruce Merrifield）于 1963 年首創發明的多肽固相合成法（SPPS，solid-phase peptide synthesis）制備獲得，且可實現工業規模的自動化機器合成。Merrifield 因此也獲得 1984 年諾貝爾化學獎。但是，Merrifield SPPS 固液兩相間的傳質效率十分低下，導致關鍵的酰基轉移動力學性質較差，在技術上每步都需要使用大大過量的化學試劑和活化劑來幫助反應效率達標，經濟性和綠色化學目標都非常不佳。并且，Merrifield SPPS 方法無法實現上述二類空間大位阻多肽序列的合成。過去六十多年間，一代又一代科研學者通過前赴后繼的努力提供了無數的改進方案，均無法獲得突破，空間大位阻多肽的固相合成成為多肽合成化學領域惡名昭著的頭號“難肽”。該合成化學層面的長期困惑嚴重制約了現代新藥研究和藥物工業生產技術的前行步伐。為了解決這一問題，該團隊開展了本次研究。

（Nature Chemistry）

多肽合成化學“拔釘子”行動

據介紹，2019 年春由該團隊的劉發博士和姚祝軍作為課題發起人開始討論多肽合成中公認的幾個難題，該團隊稱之為多肽合成化學“拔釘子”行動。第一個目標就是大空間位阻多肽的肽鍵形成問題。他們認為傳統技術的優化通道很窄，六十多年來有可能的改進都應該被研究過了，結論是至今無法突破。因此，該團隊認為必須換思路、換賽道，于是開始有了模擬核糖體功能的想法。最后形成了類核糖體方案，提出了分子機器的概念。2019 年 9 月，魏思媛同學（本次論文第一作者）從中國農業大學畢業作為五年制免試直博生來南京大學報到，課題才正式開始啟動。“期間，魏思媛同學展示了超強的學習和領悟能力、實驗動手能力和結果分析能力，以及作為湖南妹子的堅忍和毅力。在她的不懈努力下，‘關關難過關關過’，最終課題獲得全面突破。”姚祝軍表示。

隨后，他們在分子設計階段拿出了好幾套潛在方案，但其實他們并沒有能力判斷哪一種是最好的，只好由魏思媛自己挑一套開始。“記得她黯然無措了好幾天，決定像摸彩票。”姚祝軍回憶稱。由于目前的理論性預測能力不足以支持前期預判，堆積“搬磚”工作量是唯一的途徑。每一批數據出來之后，他們都要仔細分析規律，隨后針對設計進行了一次次優化，然后繼續驗證……這個過程非常考驗課題組的耐心，很多數據在出現時非常無序，他們的心情也隨之高低起伏，有時候晚上焦慮實驗結果而睡不著覺。經過四輪優化，終于獲得了比較滿意且符合規律的結果。“預期的分子機器概念曙光乍現，感覺像要開啟成功之門了。”姚祝軍說道。

接著，他們把經過優化之后的固載化 RMMR 分子機器用于“開/關”操作的動力學行為研究，確認了可操作性。然后，經過設定實驗的對比，驗證了類核糖體的酰基轉移機制的真實存在；RMMR SPPS 具備普通多肽、長肽的合成能力，并與傳統 SPPS 效果相當。然后，他們選擇個別代表性高空間位阻多肽進行合成，并與傳統 SPPS 進行了效果比較。結果非常令人欣慰，RMMR SPPS 顯示出驚人的合成優勢，甚至超越了該團隊的預期。到此，該團隊感覺他們已經勝利在望，或者已經處在“開創新紀元”的征程之中。隨后的底物擴展性研究也非常順利，范例一次次證明 RMMR SPPS 的驚人優勢效果；機器自動化合成也非常順利。“魏思媛和張徐純同學自己修訂了商品化儀器設備自帶的程序包，在實驗范例研究中獲得了優異的效果。”姚祝軍回憶稱。

與此同時，在檢驗氨基酸消旋化程度的過程中，他們一度發現新方法在耦合組氨酸 His 時發生較為明顯的消旋化，比傳統 SPPS 要高出不少，顯然這是非常不利的結果。為此，他們花了不少時間做各種嘗試，最終發現 RMMR SPPS 和 Merrifield SPPS 條件之間是可以隨意切換的，并不影響氨基酸耦合的效果。如此一來，他們采用按需切換條件的方式不僅解決了 His 偶聯中少量消旋化的問題，還進一步展示了新技術的變通性和易操作性。“所謂，研究中出現的異常往往是又一次新的發現機會。”姚祝軍表示。同時，該團隊也為本次新技術申請了中國發明專利和國際專利的知識產權保護。

（Nature Chemistry）

前面提到，研究者的毅力和堅持對于課題的成功是十分關鍵的因素。研究過程中大多數時間都是令人失望的結果，尤其在本次研究的初期充斥著體力和精神的雙重煎熬。魏思媛（現已經博士畢業）在 2023 年秋季和姚祝軍曾有過一次交流，那時研究工作大體已經成型，但尚需要征服個別公認的“硬骨頭”，比如含有密集 N-Me 氨基酸的環肽藥物——環孢菌素 A 的 RMMR SPPS 合成，如能攻克則可提升這一方案的科學高度。“但這樣的話，她就有可能無法參加原定于 2024 年 5 月組織的畢業答辯。她希望就此打住。我拒絕了這一請求，并希望她突破這一難題。她當時情緒很大，半夜向父母哭訴，把她父母嚇壞了……最終，她還是堅持住了，調整情緒投入到工作中。后來的實驗工作表明，這一難肽的合成工作并沒有想象中的艱難，RMMR SPPS 像一把神器，迅速破解了這一難題。”姚祝軍表示。后來，魏思媛順利按時完成了畢業論文答辯，并獲得了答辯專家組全優的高度評價。“我也希望以此與讀者們一起共勉，原創性研究工作不僅考驗著研究者的智慧和實踐能力，更考驗導師和學生的精神毅力。”姚祝軍總結稱。

最終，相關論文以《固定酰基轉移分子反應器可實現空間受阻肽的固相合成》（Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides）為題發在Nature Chemistry，姚祝軍和劉發擔任共同通訊作者 [1]。

圖 | 相關論文（Nature Chemistry）

如前所述，該團隊最初的開題討論瞄準了幾個長久沒有克服的多肽領域合成化學難題，他們自己將這調侃為多肽合成化學的“拔釘子”行動。在開創 RMMR SPPS 概念并突破空間大位阻多肽的固相合成與自動化合成之后，他們希望進一步深化和延伸，爭取拔除第二枚著名的”釘子”——易簇集多肽的固相自動化合成及產品分離純化難題。二者的原理有所不同，但現有 RMMR SPPS 經變通發展有望解決第二個難題；目前，該團隊這方面也已經取得了部分的階段性進展。此外，該團隊也在布局利用 RMMR SPPS 技術設計制造新型雜合形式的高空間位阻多肽，以達到優秀的細胞膜透性和代謝穩定性。所有這些努力將續寫迭代 RMMR SPPS 的技術威力，以拓展具有重要生理學意義的多肽的自動化合成版圖助力現代肽藥研究。

參考資料：

1.Wei, S., Zhang, X., Yang, X. et al. Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides.Nat. Chem.(2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01896-8

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